小量质粒快速提取试剂盒(1.5～4.5mL)

产品货号：

ALH075

中文名称：

小量质粒快速提取试剂盒(1.5～4.5mL)

英文名称：

Fast Plasmid Mini Kit(1.5-4.5 ml)

产品规格：

50次|100次|200次

发货周期：

1～3天

产品价格：

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本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

试剂盒特点：

离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
快速、方便，不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。获得的质粒产量高、纯度好，可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。

试剂盒组成：

组分	50次	100次	200次	保存
RNaseA（10mg/ml）	150μL	250μL	500μL	-20℃
溶液P1	15mL	25mL	50mL	4℃
溶液P2	15mL	25mL	50mL	室温
溶液P3	20mL	35mL	70mL	室温
漂洗液WB	15mL	25mL	50mL	室温
洗脱缓冲液EB	10mL	15mL	20mL	室温
吸附柱AC及收集管(2mL)	50套	100套	200套	室温

注意事项：

本试剂盒适用菌株为XL-1 Blue和DH5α等核酸酶含量低缺陷型菌株。所用菌株为JM系列、HB101等endA菌株或野生型菌株，核酸酶含量丰富，应购买本公司的高纯度质粒小量快速提取试剂盒。
所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C或者类似离心机。
溶液P3中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
提取质粒的量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。一般高拷贝质粒，建议接种单菌落于1.5～4.5mL加合适抗生素的LB培养基，过夜培养14～16个小时，可提取出多达20μg的纯净质粒。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应适当加大菌体使用量，使用5～10mL过夜培养物，同时按比例增加P1、P2、P3的用量，其它步骤相同。
得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。
质粒DNA确切分子大小，必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以知道。处于环状或者超螺旋状态的的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其确切大小。
洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在-20℃。质粒DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。

操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
提示：
① 第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
② 将RNase A全部加入溶液P1中，混匀，每次使用后置于2～8℃保存。
③ 将溶液P3放在冰上预冷。

取1.5～4.5mL过夜培养的菌液，9000rpm离心30秒，尽可能的倒干上清，收集菌体。
收集超过1.5mL菌液，可以离心弃上清后，在同一个1.5mL管内加入更多的菌液，重复步骤1，直到收集到足够的菌体。
用250μL溶液P1重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。
如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
加250μL的溶液P2，温和地上下翻转4～7次使菌体充分裂解，室温放置4分钟。
温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时间不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要准确的5分钟。
加350μL溶液P3，立即温和地上下翻转4～7次，充分混匀时会出现白色絮状沉淀。
冰上静置3～5分钟，13000rpm离心10分钟，小心取上清。
加入溶液P3后应该立即混匀，以免产生SDS的局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
将上一步所得上清加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），13000rpm离心30～60秒，倒掉收集管中的废液。
加入500μL漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12000rpm离心30秒，弃掉废液。
加入500μL漂洗液WB，12000rpm离心30秒，弃掉废液。
将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μL洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65～70℃水浴中加热效果更好），室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟。如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟。
洗脱体积越大，洗脱效率越高。如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于30μL，体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量。

常见问题分析：

质粒DNA产量低
- 忘加抗生素，非质粒转化细胞过度生长-建议：
  确保固体、液体培养基中都加入了适当的抗生素。
- 细菌培养时间太长，老化细菌开始裂解-建议：
  接种过夜培养的新鲜单菌落于加了合适抗生素的培养基中，培养12～16个小时。
- 使用了低拷贝数质粒-建议：
  使用高拷贝数质粒，低拷贝数质粒应该适当加大处理体积。
- 细菌培养时间过短，细菌浓度过低-建议：
  细菌培养到[A600]吸光值为2 -4时，收集菌体。
- 细菌细胞裂解不完全-建议：
  - 使用建议的菌体处理量，不要过量；
  - 涡旋或者吹打，确保菌体充分重悬于溶液P1中，不应该见到未散开的细菌团块；
  - 加入裂解液P2后，应该是粘稠和透明的。
- 质粒DNA产量使用分光光度计定量不准确-建议：
  分光光度计定量常常偏高，使用琼脂糖电泳/EB染色定量。
- 洗脱效率不高-建议：
  请阅读操作步骤8和注意事项6。
未提取到质粒DNA
- 漂洗液WB中忘加无水乙醇-建议：
  第一次实验时，在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇
- 质粒洗脱液含有较多乙醇，琼脂糖电泳/EB染色定量时质粒DNA漂出上样孔-建议：
  - 确保已经做了步骤8，将离心吸附柱的残留乙醇去除；
  - 或者适当提高上样缓冲液浓度。
质粒DNA下游酶切不能切开或者酶切不完全
- 忘记做步骤8，乙醇抑制了酶切反应-建议：
  做步骤8，然后空气中晾几分钟，让残留乙醇挥发。
- 一些硅基质膜成分一起洗脱下来，抑制了酶切反应-建议：
  将洗脱的回收DNA溶液13000rpm再离心1分钟，小心取上清使用。
质粒DNA降解或者无质粒DNA
- 核酸酶活性太高-建议：
  请选用本公司的高纯度质粒提取试剂盒（附带去核酸酶的去蛋白液PE）
基因组DNA污染
- 裂解时基因组DNA被剪切打断了-建议：
  做步骤3时，轻柔颠倒混匀，不要涡旋或者剧烈震荡。
质粒DNA缺口或者电泳时超螺旋带前出现变性质粒带
- 步骤3裂解时间过长-建议：
  裂解时间不要超过5分钟。
产物中含有RNA污染
- 第一次做实验时，忘记将RNase A加入P1溶液，RNase A失活或者起始处理量过量-建议：
  - 第一次实验前确保将RNase A加入了溶液P1；
  - P1溶液超过3个月的，可加入一些新RNase A；
  - 处理量不要过量；
  - 菌体重悬于P1溶液后可放置几分钟让RNaseA充分作用后再进行下一步。

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